【摘 要】

目的研究還原型谷胱甘肽對乳鼠心肌細胞缺氧/復氧（A/R）損傷的影響。方法建立心肌細胞A/R損傷模型，隨機分為5組：A組，正常對照組;B組，單純缺氧/復氧（A/R低氧2h，復氧1h）組;C、D、E組為還原型谷胱甘肽處理組，加入還原型谷胱甘肽（GSH）分別使其終濃度為40、80、160mg/L，后A/R。于復氧后測定各組培養液中乳酸脫氫酶（LDH）變化及細胞內丙二醛（MDA）含量和細胞存活率。結果與正常組相比，單純低氧/復氧組LDH漏出量、MDA水平顯著升高（P<0。01），細胞存活率顯著降低（P<0。01）。與缺氧/復氧組比較，各谷胱甘肽處理組上述變化明顯減輕（P<0。05）。結論還原型谷胱甘肽對乳鼠心肌細胞A/R損傷具有保護作用，并具有濃度依賴性。

【關鍵詞】

還原型谷胱甘肽，心肌細胞，缺氧，復氧

1材料與方法

1。1材料實驗用1～3天的Wistar大鼠乳鼠，山東大學實驗動物中心提供，雌雄不拘;DMEM培養基由愛博公司出品;胎牛血清為美國Gibco公司出品;胰酶為Sigma公司出品;丙二醛（MDA），乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒均購自南京建成生物研究所;還原型谷胱甘肽（古拉定）由LaboratorioFarmaceuticoC。T。S。R。1生產（批號：4027）。

1。2乳鼠心肌細胞培養無菌取出生1～3天大鼠乳鼠心臟，剪碎后用0。25%胰酶消化4～5次，取除第1次以外的上清，用含15%胎牛血清的高糖DMEM中止消化，離心取心肌細胞沉淀，加入培養液，集中混勻制成懸液，應用差速貼壁法分離純化心肌細胞，以5×105/ml的培養密度接種于24孔培養板中，在CO2培養箱中培養，48h后換液。

1。3實驗分組及操作程序試驗分為5組，每組重復8孔，A組為正常對照組（培養板置培養箱中持續孵育3h結束實驗）;B組為單純缺氧/復氧組（A/R缺氧2h，復氧1h）：將培養板置于充有99。5%氮氣的缺氧孵育器中37℃密閉培養2h，再以95%氧氣+5%二氧化碳進行復氧1h;C組，D組，E組為古拉定處理組，加入古拉定使其終濃度分別為40、80、160mg/L。各組缺氧前、復氧前均給藥。

1。4實驗檢測指標（1）計數細胞搏動：在倒置顯微鏡觀察并計數心肌細胞搏動的頻率及節律。（2）細胞存活率計數：采用臺盼藍排斥法檢測，各組取少許細胞混懸液，0。4%臺盼藍混勻2min，按白細胞計數法在光鏡下計數藍染細胞。臺盼藍攝取率=藍染細胞/（藍染細胞+未藍染細胞）×100%。（3）LDH及MDA活性及含量測定：實驗結束后按試劑盒說明測定。

1。5統計學方法數據以均數±標準差（x±s）

2結果

2。1古拉定對缺氧/復氧心肌細胞搏動的影響正常培養對照組心肌細胞搏動相對恒定，節律規則;A/R組心肌細胞搏動頻率減慢，搏動幅度減弱，節律不齊，有部分停搏，與對照組相比，差異有非常顯著性（P<0。01）;各古拉定處理組明顯逆轉A/R損傷造成的搏動頻率和節律異常，與A/R組比較差異有顯著性（P<0。05）。

2。2古拉定對心肌細胞缺氧/復氧損傷LDH及MDA的影響結果表明，A/R心肌損傷是十分明顯的，而古拉定能明顯減輕這種損傷，古拉定處理組各觀察指標均差異有顯著性，因此提示古拉定對于缺氧/復氧心肌細胞損害具有保護作用，且存在量效關系。

3討論

3。1還原型谷胱甘肽對缺氧/復氧心肌細胞損傷的影響大量研究表明，缺血再灌注期間大量氧自由基的產生可造成細胞損傷。氧自由基導致細胞損傷主要環節為作用于細胞外基質，使膠原和透明質酸崩解，使膜磷脂結構的多聚不飽和脂肪酸過氧化而直接損傷細胞膜;肌漿網和線粒體崩潰，心肌細胞在缺氧缺糖條件下，ATP產生減少，代謝障礙，代謝產物堆積，使膜穩定性降低，溶酶體釋放，導致生物損傷、變性，使LDH釋放在培養基中，同時再給氧時氧自由基增加，細胞膜受攻擊，細胞膜損傷。

細胞內LDH進一步增加，故LDH釋放量是觀測缺血再灌注損傷重要指標。脂質過氧化產物丙二醛（MDA），其含量變化可作為評定自由基生成及對膜脂質雙層結構破壞的指標。本實驗從培養的未成熟鼠心肌細胞入手，排除了在體和離體灌注模型中神經、體液因素及其他混雜細胞因素的影響，直接利用還原型谷胱甘肽處理培養的未成熟鼠心肌細胞，結果發現還原型谷胱甘肽各濃度組均可降低缺氧/復氧損傷造成的心肌細胞死亡率，減少細胞內LDH漏出，減少細胞內MDA生成，且存在量效關系，表明還原型谷胱甘肽對未成熟鼠心肌細胞有保護作用。

3。2還原型谷胱甘肽對缺氧/復氧心肌細胞損傷的保護機制還原型谷胱甘肽（GSH）對清除自由基有重要作用，它是機體內一種重要的抗氧化劑，它能有效清除氧化產生的自由基，維持細胞內環境的穩定，并在使暴露于氧化環境的組織免受自由基損害方面起重要作用。GSH在谷胱甘肽過氧化物酶（GSH?PX）的作用下對有機過氧化物（ROOH）和無機過氧化物（H2O2）起重要清除作用，其還可以起維生素C還原劑的作用，使維生素C成為還原型而不斷清除超氧自由基。

近期有研究表明，GSH可維持線粒體內膜巰基基團的還原狀態。當GSH含量下降，內源性自由基攻擊線粒體蛋白巰基的可能性增大，一方面使酶活性降低，影響線粒體氧化代謝的3個關鍵酶及電子傳遞鏈中酶的活性，NADH減少，ATP產生減少。另一方面，導致膜蛋白巰基氧化交聯，構型改變，線粒體膜滲透性轉運通道打開，鈣釋放增加，胞漿鈣上升，激活細胞膜PLA2和中性蛋白水解酶（CANP），導致細胞膜的損傷或死亡。本實驗表明補充外源性GSH，對保護細胞膜的功能可能具有重要意義，對臨床各種疾患造成的心肌細胞缺氧/復氧損傷有保護作用。